RNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型）使用說明書
原理概述：
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術：在常溫恒溫下，特殊修飾的反轉錄酶利用特異性引物和模板RNA合成cDNA鏈，反應體系中的重組酶、單鏈DNA結合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進行快速核酸擴增反應。依賴nfo酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用膠體金技術（三明治夾心法）可以對最終結果進行檢測。
產品特點：
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時間短（僅需12 mins）等優點，反應組分為干粉狀態，操作簡便，易于保存。
本試劑對設備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進行反應操作，無需購買PCR擴增儀等價格高昂的專屬設備。
引物設計：
建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標記一個修飾基團（常用生物素）。引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。
熒光探針設計：
在上下游引物中間，設計一段長度為46-52nt與目的片段互補的序列；5’端修飾一個抗原標記（典型FAM）; 在5’端和3’末端的中部位置標記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為nfo的識別位點；3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer等。
試劑盒組成：
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組成 |
含量 |
|
A buffer |
1.6 mL×1管 |
|
B buffer |
150 μL×1管 |
|
試劑 |
48份 |
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使用說明書 |
1份 |
試劑盒儲存：
運輸條件：低溫運輸；
儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復凍融；
產品有效期：12個月。
操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。
1) 每個干粉反應管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混勻，否則會對實驗效果產生影響）；
2) 每個反應管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應管中）；
3) 向反應管中依次加入11.5 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根據核酸濃度調整加入的核酸模板體積，并相應調整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為13.5 μL）；
4) 最后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（對于多個反應，建議將B buffer加至反應管的蓋子內側，上下顛倒反應管8-10次混勻）；
5) 混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入恒溫設備中37-39 oC孵育8-12 mins；
6) 反應結束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 mins內觀察質控線與檢測線判讀結果。
體系配制
|
組分 |
體積（μL） |
|
A buffer |
29.4 |
|
上游引物(10 μM) |
2 |
|
下游引物(10 μM) |
2 |
|
探針(10 μM) |
0.6 |
|
ddH2O和核酸模板 |
13.5 |
|
B buffer |
2.5 |
|
總體積 |
50 |
注意事項：
1． 由于試劑盒靈敏度非常高，在進行反應時請注意避免微量核酸污染，并盡量考慮設置空白對照以確認是否有核酸污染。
2． 試劑盒保質期12個月。每次使用時，請取出實驗所需的MIRA反應單元的數量，置于冰浴條件下并在8小時內使用；剩余部分，請置于存儲條件下。
相關產品：
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產品名稱 |
貨號 |
規格 |
目錄價格 |
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DNA恒溫快速擴增試劑盒（基礎型） |
WLB8201KIT |
48份/盒 |
2400 |
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48份/盒 |
2400 |
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WLN8203KIT |
48份/盒 |
2400 |
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WLRN8206KIT |
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2500 |
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2500 |
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RNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型） |
WLRE8205KIT |
48份/盒 |
2500 |
|
HybriDetect試紙條 |
WLFS8201 |
50條/包 |
1650 |
