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產品說明：

產品描述:

Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，發綠色熒光（Ex=490 nm，Em=515 nm）。 因其在傳統的Calcein（鈣黃綠素）基礎上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后，Calcein-AM（本身不發熒光）被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內并發出強綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA）相比，由于Calcein, AM細胞毒性極低，是最適合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記。作為核染色染料的碘化丙啶不能穿過活細胞的細胞膜，它穿過死細胞膜的無序區域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產生紅色熒光(激發：535 nm，發射：617 nm)，因此PI僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545 nm激發，僅可觀察到死細胞。根據以上特點，Calcein, AM和PI經常被結合用來作為活細胞和死細胞的雙重染色。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，我們建議個別確定 Calcein, AM 和 PI的合適濃度。

本品為粉末形式提供的Calcein-AM，超純級別（≥95%），可與碘化丙啶（PI）聯合使用，用于活細胞和死細胞的同時檢測。或者直接購買翊圣提供的Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒。

使用方法：

1. 儲存液的配制

本品是以粉末形式提供的，根據工作液的濃度將其配制成1000×的儲存液，儲存液配制范圍可為1～50 mM。例如使用的工作液為5 μM，那么可配制5 mM的儲存液，也就是向50 μg Calcein, AM（Mw：994.86）內加入10 μl 細胞培養級別的DMSO即可得到所需濃度的儲存液。

2. 染色步驟

對于大部分細胞，鈣黃綠素Calcein, AM的工作液濃度為2-5 μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定 Calcein-AM的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最低的探針濃度得到最好的熒光結果。
1）使用時，取一管適量的Calcein, AM儲存液（1000×），用PBS（或Hanks和Hepes）緩沖液將其稀釋成相應濃度的染色工作液。
        注：有時候可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein AM儲存液內來增強其水溶性。制備染色工作液前，取一管需要用的Calcein AM儲存液內加入等體積的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。含Pluronic F127的Calcein AM溶液不可長期保存，現配現用。
2）對于貼壁細胞，先用胰酶-EDTA消化細胞，離心收集細胞（1000 rpm，3 min）。對于懸浮細胞，直接離心收集細胞。
3）去上清，用PBS（或者其他緩沖液）充分清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

4）用1/10細胞培養基體積的Calcein, AM染色工作液重懸細胞，37℃培養細胞15～30分鐘。
        注：如果細胞本身含有有機陰離子轉運體，需加入丙磺舒（probenecid，1-2.5 mM）或者苯磺唑酮（sulfinpyrazone，0.1-0.25 mM）到孵育體系內以降低去酯化染料calcein泄露到胞外。
5）用PBS（或者其他緩沖液）洗滌細胞兩次去除多余的染料。
注：如有必要，使用含有陰離子轉運抑制劑的緩沖液來進行細胞清洗】

6）用含490 nm激發波長，515 nm發射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細胞。

注意事項：

1）對于微量試劑，開封前，請稍微離心一下，以保證粉末落入管底。
2）由于Calcein-AM對濕度非常敏感，本粉末保存的過程中一定要保持干燥。對于配制好的Calcein-AM儲存液需要分裝凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein-AM工作液必須現配現用。

3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

本產品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。